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    多肽縮合的試劑

          目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來(lái)完成接肽反應，最早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱(chēng)酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應試劑危險以及制備比較復雜，逐漸被后來(lái)的縮合試劑取代，按照其結構可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。
     
    1.2.1．碳二亞胺型 
          主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反應，由于反應中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中，可以通過(guò)過(guò)濾除去，應用仍然相當廣泛。EDC.HCl因為其水溶解性的特點(diǎn)，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當成功。但是該類(lèi)型的縮合試劑的一個(gè)最大的缺點(diǎn)，就是如果單獨使用，會(huì )有比較多的副反應，但是研究表明如果在活化過(guò)程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應控制在很低的范圍。其反應機理如下： 


    圖2  DIC活化反應機理 

    1.2.2．鎓鹽型 
         鎓鹽型縮合試劑反應活性高，速度快，現在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過(guò)程中需要添加有機堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。其反應機理如下： 


    固相合成中常用樹(shù)脂 
           固相多肽合成中樹(shù)脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交聯(lián)度在1-2%之間，現在使用的大多是1%，因為這種交聯(lián)度下，樹(shù)脂在DMF，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結構，反應物分子可以在樹(shù)脂內部自由移動(dòng)。樹(shù)脂中最關(guān)鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹(shù)脂上，一端作為反應位點(diǎn)。目前廣泛使用的樹(shù)脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因為其對酸非常穩定，需要在HF，TFMSA等強酸條件下才能夠切割下來(lái)。 


    固相合成切割方法
           固相多肽合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過(guò)HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后多肽產(chǎn)品。
            由于選擇的樹(shù)脂不同，氨基酸序列不同，在切割時(shí)候，選擇的切割方法也不完全相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對于PAM，MBHA樹(shù)脂，一般采用HF切割，切割過(guò)程中需要添加對甲苯酚，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對于Wang，Rink-Amide，Trt樹(shù)脂，一般采用TFA切割，切割過(guò)程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。
          這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應過(guò)程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對部分氨基酸側鏈的進(jìn)攻導致的副反應，比較容易產(chǎn)生副反應的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹(shù)脂。
          常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反應一般是在室溫條件下2h-4h。

    困難序列多肽合成
          固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問(wèn)題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因為有些多肽序列在樹(shù)脂上形成β-折疊，改變了樹(shù)脂的溶脹性能，還有可能將反應的活性位點(diǎn)埋藏在樹(shù)脂里面，這樣使得反應很難進(jìn)行，目前報道使        用的主要方法有：
    使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液
    提高反應溫度，或采用微波方法
     使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。
    使用溶脹性能更好的PEG-PS樹(shù)脂，同時(shí)減少樹(shù)脂擔載量（0.05-0.2mmol/g）



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