二硫鍵廣泛存在與蛋白結構中，對穩定蛋白結構具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過(guò)序列中的2個(gè)Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過(guò)氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過(guò)程， 可以通過(guò)Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應進(jìn)程進(jìn)行監測。
如果多肽中只含有1對Cys，那二硫鍵的形成是簡(jiǎn)單的。多肽經(jīng)固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中進(jìn)行氧化。
當需要形成2對或2對以上的二硫鍵時(shí)，合成過(guò)程則相對復雜。盡管二硫鍵的形成通常是在合成方案的最后階段完成，但有時(shí)引入預先形成的二硫化物是有利于連合或延長(cháng)肽鏈的。通常采用的巰基保護基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。我們分別列出兩種以2-Cl樹(shù)脂和Rink樹(shù)脂為載體合成的多肽上多對二硫鍵形成路線(xiàn)：
二硫鍵反應條件選擇
二硫鍵即為蛋白質(zhì)或多肽分子中兩個(gè)不同位點(diǎn)Cys的巰基（-SH）被氧化形成的S-S共價(jià)鍵。 一條肽鏈上不同位置的氨基酸之間形成的二硫鍵，可以將肽鏈折疊成特定的空間結構。多肽分 子通常分子量較大，空間結構復雜，結構中形成二硫鍵時(shí)要求兩個(gè)半胱氨酸在空間距離上接近。 此外，多肽結構中還原態(tài)的巰基化學(xué)性質(zhì)活潑，容易發(fā)生其他的副反應，而且肽鏈上其他側鏈 也可能會(huì )發(fā)生一系列修飾，因此，肽鏈進(jìn)行修飾所選取的氧化劑和氧化條件是反應的關(guān)鍵因素， 反應機理也比較復雜，既可能是自由基反應，也可能是離子反應。
反應條件有多種選擇，比如空氣氧化，DMSO氧化等溫和的氧化過(guò)程，也可以采用H2O2，I2， 汞鹽等激烈的反應條件。
空氣氧化法：
空氣氧化法形成二硫鍵是多肽合成中最經(jīng)典的方法，通常是將巰基處于還原態(tài)的多肽溶于水中，在近中性或弱堿性條件下（PH值6.5-10），反應24小時(shí)以上。為了降低分子之間二硫鍵形成的可能，該方法通常需要在低濃度條件下進(jìn)行。
碘氧化法：
將多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘進(jìn)行氧化，反應15-40min。當肽鏈中含有對碘比較敏感的Tyr、Trp、Met和His的殘基時(shí)，氧化條件要控制的更精確，氧化完后，立即加入維生素C或硫代硫酸鈉除去過(guò)量的碘。
二對及多對二硫鍵成環(huán)策略
當序列中有兩對或多對二硫鍵需要成環(huán)時(shí)，通常有兩種情況：
自然隨機成環(huán):
序列中的Cys之間隨機成環(huán)，與一對二硫鍵成環(huán)條件相似；
定點(diǎn)成環(huán)：
定點(diǎn)成環(huán)即序列中的Cys按照設計要求形成二硫鍵，反應過(guò)程相對復雜。在 固相合成多肽之前，需要提前設計幾對二硫鍵形成的順序和方法路線(xiàn)，選擇不同的側鏈 巰基保護基，利用其性質(zhì)差異，分步氧化形成兩對或多對二硫鍵。
通常采用的巰基保護 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。
