抗原多肽選擇的基本原則
發(fā)布時(shí)間：2020-09-15 06:25:23瀏覽次數：
1. 盡可能是在蛋白表面
2、保證該段序列不形成α-helix
3、N,C端的肽段比中間的肽段更好
4、避免蛋白內部重復或接近重復段的序列
5、避免同源性太強的肽段
6、交聯(lián)可以交聯(lián)在N、C兩端，選擇依據就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的一端
7、序列中不能有太多的Pro,但有一兩個(gè)Pro有好處，可以使肽鏈結構相對穩定一些，對產(chǎn)生特異性抗體有益。
為了使生產(chǎn)抗體獲得最佳效果，仔細地設計抗原多肽是很有必要的，設計應滿(mǎn)足一個(gè)基本條件：在免疫過(guò)程中，該抗原既不會(huì )產(chǎn)生過(guò)強的免疫反應，同時(shí)又能產(chǎn)生出對感興趣的蛋白有結合能力的抗體。盡管抗原設計是一個(gè)很復雜的課題，有諸多需要注意的細節，根據我們所積累的經(jīng)驗，有幾點(diǎn)關(guān)鍵的基本設計原則可以提供給大家參考：
1、確定抗體的用途
新開(kāi)展一個(gè)研究項目，弄清楚所感興趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特別是如果知道蛋白的結構會(huì )對選擇抗體易于接觸和識別的識別區域有很大的幫助。然而，在沒(méi)有這樣精確的結構信息（多數是這種情況）的情況下，了解研究的用途會(huì )影響多肽設計的策略。例如：如果研究重點(diǎn)是集中在蛋白的不同區域，如C端或N端，或在一種特定狀態(tài)下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列設計的多肽和產(chǎn)生的相應的抗體在應用上應該沒(méi)有太大的困難，然而，蛋白的構象將影響抗體與其識別區域之間的相互作用。這種情況下可能存在的問(wèn)題是如果在折疊的蛋白中，該識別區域被藏在蛋白的內部，抗體將無(wú)法接觸到該區域。（無(wú)法產(chǎn)生相互作用）。
2、識別區域的選擇原則
一般說(shuō)來(lái)最理想的抗原性識別區域應具備親水、位于蛋白表面和結構上易變形性等特點(diǎn)。因為在大多數的天然環(huán)境中，親水區域傾向于集中在蛋白表面，而疏水區域常常被包裹在蛋白內部，同樣道理，抗體只能與在蛋白表面發(fā)現的識別區域相互作用，而當這些識別區域有足夠的結構易變形性而轉移到抗體可接觸的位置時(shí)，將會(huì )與抗體間有很高的親和性。
3、連續的與不連續的識別區域
連續的區域是指由連續的氨基酸序列構成的識別區域。大多數抗體是針對連續識別區域的，抗體能與這類(lèi)區域以很高的親和力相結合表明這段序列不在蛋白內部。不連續的識別區域是代表有一定折疊的一段多肽序列，或是將兩段分離開(kāi)的多肽連在一起的抗體的識別區域。在某些情況下，針對這樣不連續識別區域的抗體也能產(chǎn)生，只是用來(lái)免疫的抗原多肽必須具備與該不連續識別區域相似的二級結構，而序列的長(cháng)度需要符合相關(guān)的要求。
4、基本建議
為了避免識別區域隱藏在蛋白內部的風(fēng)險，我們通常建議選擇蛋白的N，C兩端來(lái)產(chǎn)生的相應的抗體。因為在完整的蛋白中，N，C兩端通常是暴露在蛋白表面的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太強，不適合作為抗原。
5、序列的長(cháng)度
通常我們建議抗原多肽的序列長(cháng)度在8-20個(gè)氨基酸殘基之間，如果太短，就有多肽太特殊、所產(chǎn)生的抗體與天然蛋白之間的親和力（結合能力）不夠強的風(fēng)險，同樣，如果序列長(cháng)度超過(guò)20，將有可能引入二級結構，所產(chǎn)生的抗體失去特異性的可能，而且肽鏈越長(cháng)，通常合成難度增大，不易獲得高純度的產(chǎn)品。
6、載體蛋白交聯(lián)的選擇
基本原則：將載體蛋白加在遠離抗體識別區域的一端，在序列中沒(méi)有Cys的情況下在N或C端加上Cys為交聯(lián)的首選方法。
7、常用分析軟件
MacVecfor TM ;DAN star TM;PC-Gene TM
多肽不穩定的原因：
脫酰胺反應：在脫酰反應中，Asn/Gln 殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應的進(jìn)行。 在A(yíng)sn-Gly-結構中的酰胺基團更易水解，位于分子表面的酰胺基團也比分子內部的酰胺基團 易水解。
氧化多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過(guò)氧化物的污染，二是多肽的自發(fā)氧 化。在所有的氨基酸殘基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖 溶液對氧化也都有影響。
水解：多肽中的肽鍵易水解斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂，尤其是 Asp-Pro和Asp-Gly 肽鍵。
形成錯誤的二硫鍵：二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯誤的二硫鍵，導致三 級結構改變和活性喪失。
消旋：除Gly外，所有氨基酸殘基的α碳原子都是手性的，易在堿催化下發(fā)生消旋反應。其 中Asp殘基最易發(fā)生消旋反應。
β-消除：β-消除是指氨基酸殘基中β碳原子上基團的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等 殘基都可通過(guò)β-消除降解。在堿性PH下易發(fā)生β-消 除，溫度和金屬離子對其也有影響。
變性、吸附、聚集或沉淀變性一般都與三級結構以及二級結構的破壞有關(guān)。在變性狀態(tài)，多 肽往往更易發(fā)生化學(xué)反應，活性難以恢復。在多肽變性過(guò)程中，首先形成中間體。通常中間 體的溶解度低，易于聚集，形成聚集體，進(jìn)而形成肉眼可見(jiàn)的沉淀。
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